Биотрансформаций ДЛЯ БУДУЩИХ GREEN

Биокатализаторов предлагаем зеленые альтернативы химии для некоторых сложных химических реакций.

Признание биокатализаторов - ферментов или целых клеток - как важные инструменты производства увеличился в химической и фармацевтической промышленности в последние годы. Биокатализаторов, можно упростить, а в некоторых случаях даже позволить, производство сложных химических веществ и наркотиков интермедиатов. Они часто работают stereoselectively, устраняя необходимость в сложных разделения и очистки шаги, несмотря на увеличение доходности. Кроме того, они, как правило, безопасных и экологически чистых. Например, биокаталитический реакции может быть запущен в мягких условиях (например, окружающей температуры и давления, нейтральной реакцией среды, водных растворителей). Кроме того, сами биокатализатора доброкачественных реагентов; тяжелые металлы или сильных кислот или оснований не требуется.

Неудивительно, что компании, приняв "зеленые" принципы обращаются к биокатализаторов в процессе разработки их производственных процессов. Примеры, представленные в этой статье основываться на опыте автора в развивающихся биокатализаторов для использования в фармацевтической отрасли под эгидой биотрансформации программы компании Pfizer. Здесь термин "биотрансформации" означает использование ферментов или микроорганизмов, как биокатализаторов для выполнения химических реакций. Использование микроорганизмов и ферментов в производстве имеет долгую историю безопасности, например, в микробных антибиотиков и в пищевой промышленности (например, использование кисломолочных продуктов, как йогурт, глюкозы изомераза сделать высокого кукурузный сироп фруктозы).

Биотрансформация научных исследований и разработок, как правило, осуществляются различные группы ученых: микробиологов, имеющие опыт в целом ферментации клетки, химики, имеющие опыт в использовании ферментов для кирального резолюций и этапы процесса и молекулярных биологов, которые могут клонировать и манипулировать генами, и их экспрессия в клетках . Их целью является содействие раннему выявлению и развитию биокаталитической шаги для синтетических маршрутов фармацевтической продукции. Реализация этой цели может открыть двери для новых возможностей процесса в то время как синтетические маршрута находится в стадии разработки.

Биокатализаторов наиболее ценны для реакций не так легко сделать стандартными химии. Окисление / снижение реакции являются общими в литературе и включить hydroxylations, стереоселективный сокращения кетон, окисления спиртов до карбоновых кислот и окисления гетеро функции, такие как азот и сера. Гидролитических ферментов, возможно, являются наиболее развитыми биокатализаторов и включают в себя upases, эстераз, и, совсем недавно, нитрилаз. Oand N-demethylations, общие реакции в метаболизме лекарств, могут быть выполнены с использованием поклеточного биокаталитической систем.

Есть небольшое количество биокаталитической реакции, которые в настоящее время возможным благодаря тому, ферменты от природы обычно не хватает активности, избирательности и стабильности, необходимых для коммерческого использования. Тем не менее, молекулярной биологии в настоящее время инструменты позволяют быстрое оптимизация природных ферментов, и поэтому многие другие ферменты, потенциально доступных для развития коммерческих биокатализаторов.

Хотя возможности ферментов в синтетических приложениях было отмечено в литературе на протяжении многих лет, биокатализ был недостаточно ферментов, поскольку от природы обычно не хватает активности, избирательности и стабильности, необходимых для коммерческого использования. Чтобы воспользоваться этой возможностью, Pfizer в прошлом году вступил в сотрудничестве с Codexis использовать свои запатентованные "ген перетасовки" технологии для разработки более совершенных ферментов для синтеза фармацевтических. "Гена шаркая" работают методов молекулярной биологии построить химерных генов последующим высоким скрининга для выявления новых фермента варианты с заданными свойствами.

Биотрансформаций продемонстрировали в лабораторных условиях

Pfizer ученые исследовали биокаталитической альтернатива реакции окислительного преобразования метильных групп в карбоновых кислот, как показано на рисунке 1. Химических маршрут на 2-quinoxalinecarboxylic кислоты (QCA), проходит через высоких энергий (взрывоопасных) и потенциально мутагенных промежуточные продукты, и, очевидно, плохо масштабируется. Микробного окисления ароматических метильных групп хорошо прецедентов в литературе, и культура были найдены, что выполняют окисления на 2-methylquinoxaline (2-MQ). В этом случае все клетки были предпочтительнее, поскольку изолированные ферменты клетки содержат три ферментов, которые действуют последовательно, первая hydroxylating метильных групп, а затем окисляя спирт в альдегид, а затем в карбоновые кислоты.

Таким образом, весь процесс ячейки предназначены для преобразования 2-MQ с использованием QCA Pseudomonas putida, выращенных на бензилового спирта - индуктор и источника углерода. Как показано на рисунке 2, это биотрансформации дает 80% доходности, производя 10 г / л QCA в чуть более 4 дней. Концентрации продуктов также выше, чем обычно можно увидеть с незастроенных микробных биотрансформации содействия восстановлению. Кроме того, микробного маршрута заменяет три химических шаги с 1 биотрансформации, что явно указывает, что этот процесс будет стоимость конкурентоспособной химической продукции на промышленном масштабе.

В рамках другого проекта, ученые искали альтернативу химической O-деметилирования фармацевтических промежуточных избежать поколения от бромистого метила, парниковых газов. Грибы были обнаружены, которые могли бы преобразовать исходный материал, представляющий собой смесь ELS диастереомеров, diastereoselectively требуемый продукт (рис. 3). Другие грибы к противоположному диастереомер выборочно, или сделал как диастереомерная продукции.

Гидролиз нитрилов является еще одним важным реакции в развитие лекарственной интермедиатов. Химический подход обычно требует сильной кислоты или основания, и часто не регио-и / или стереоселективный. В отличие от некоторых ферментов нитрилазной показывают отличные регио-и стереоселективностью. Рисунок 4 изображает нитрилазной реакцию, которая гидролизует только одну из нитрила групп динитрил подложки. Выход целевого cyanoacid составляет более 95% при определенных условиях, что значительно лучше, чем урожайность получена с помощью химического гидролиза динитрил. Кроме того, ферментативной реакции устраняет потребность в шаг, чтобы очистить нежелательных regioisomer и других побочных продуктов.

Когда рацемического препарата решается в конце синтеза, половина материала потеряли и должны быть переработаны или ликвидированы. Поэтому, желательно, чтобы представить хиральных центров как можно скорее в синтетических маршрута. Рисунок 5 изображает биоконверсии, который был разработан, чтобы избежать конце резолюции и уменьшить общее количество шагов в реакции. Бактерии, дрожжи и другие грибы были обнаружены, которые могли бы выполнить указанные асимметричные сокращения кетон. На лабораторном масштабе, дрожжи Zygosaccharomyces bailii превращается 78% от промежуточного (20 г / л) в требуемое киральной спирта (99% энантиомерной избыток (ее)).

Биотрансформации группы в Pfizer также принимает участие в проведении целого биотрансформаций ячейки для производства наркотиков метаболитов для определения характеристик. Это возможно, поскольку микроорганизмы содержат ферменты, которые схожи с наркотиками ферментов биотрансформации в организме человека (в частности, микробных ферментов цитохрома P450), а также микробы часто делают то же, как метаболиты млекопитающих под воздействием наркотиков.

Многие метаболиты гидроксилированных производных наркотиков и может быть довольно трудно сделать с помощью стандартных химических методов. Иногда совершенно новый синтетический путь должен быть разработан, требующих значительных затрат времени и ресурсов. Кроме того, структура препарата метаболиты не всегда известно, с уверенностью в начале процесса разработки лекарств. Микробной подготовки избежать этих трудностей и могут быть использованы для источника метаболитов для структуры подтверждение, биологических характеристик и в качестве стандартов. В целом, доходность, концентрации и производительности, полученные в ходе подготовки метаболит не так важны, так как они находятся в процессе шаги для коммерческого производства. Как правило, только небольшое количество метаболитов не требуется.

Сайт гидроксилирования в метаболита на рисунке 6 не ясно, с начала исследований в микросомах. Исследователи обнаружили микроорганизмы, которые сделали желаемого метаболита, и очистил 7 мг для определения структуры и характеристика биологической активности и метаболической стабильности. Эта информация предоставляется представление о структуре деятельности отношения (SAR) молекулы вблизи от места гидроксилирования. Химики Discovery проекта использовал новые данные, чтобы выбрать нового поколения для синтеза соединений.

Ну, характеризующейся метаболитов на рынке препаратов, иногда используется для оценки потенциальных новых лекарств, в развитии взаимодействия с другими лекарственными средствами. Грамм количества 4'-hydroxydiclofenac (рис. 7) были необходимы для этой цели. Этот метаболит был на коммерческой основе, но только в малых количествах и высокой стоимости. Ученые выяснили, что грибок производит эту гидроксильные производные от диклофенака с 99% доходностью и использовать всю ячейку микробных биотрансформации для производства 6 г метаболита. Стоимость приобретения столько 4'-hydroxydiclofenac было бы 24 млн. долл. США.

Всего против ферментов клеток

И все-клеток и изолированного фермента биотрансформаций полезны. Решение о применении одного метода по сравнению с другими, как правило, в зависимости от конкретного случая. Всего клетки лучше всего, когда сложные или мембранных ферментов, таких как мульти-ферментативных реакций или цитохром P450 ферментов, участвуют. Всего bioconversions ячейке можно быстро расширить представить материалы для токсикологии и клинических исследований. Тем не менее, все клетки часто не будет мириться с высокими концентрациями субстрата или продукта (> 1 г / л), и, как правило, не могут быть использованы для реакции в органических растворителях.

В отличие от изолированных ферментов просты в использовании и не требуют культивирования знаний или оборудования. Ферментативной реакции также дают чистых продуктов, чем все переходы ячейки, поскольку Есть нет побочных реакций, происходящих из других ферментов в клетках. Кроме того, Есть нет среднего или клеточных компонентов должен быть удален. С другой стороны, изолированных ферментов может быть дорогостоящим, если они не используются в больших масштабах (например, моющие средства), или может быть использован для нескольких партий (например, иммобилизованных ферментов, которые могут быть восстановлены и повторно использовать). Как фермента инженерии стали более распространенными, затраты могут стать менее важной проблемой.

В общем, все ячейки bioconversions лучше всего подходят для подготовки метаболита, где скорость более важна, чем стоимость. В отличие от bioconversions для изготовления фармацевтических промежуточных должны быть экономически выгодной по сравнению с химическими методами. Таким образом, доходность, концентрации продуктов, объемная производительность, стабильность, легкость извлечения продукта и фермента стоимость являются критическими параметрами.

Чтобы быть наиболее полезным для реакции скрининга, биокатализатор коллекция должна включать в себя коммерческие ферментов и микроорганизмов, известных выполнить биотрансформаций. Например, коллекция Pfizer составляет около 300 коммерческих ферментов, в том числе upases, эстераз нитрилаз и ketoreductases, и более 500 штаммов микроорганизмов. Ферментов, одетые в микротитровальных пластин и замороженных для простоты использования. Культур в основном из государственных коллекций культур, таких, как Американский тип культуры Коллекция (ATCC), и были отобраны на основе докладов с описанием интересных активности биотрансформации. Коллекция содержит около 40% бактерий, 35% мицелиальных грибов и 20% дрожжей.

Микробы оценка высокую оценку

Экспериментальные работы в Pfizer, показал, что нитевидные культур, как бактерии и грибки, являются, скорее всего, выполняют полезную bioconversions. Протокол поклеточного отбора обычно включает лишь около 100 организмов, которые выращиваются в трубочки, дозированная с подложкой на 0,1-1,0 мг / мл и инкубировали в течение 4-6 дней. Содержание трубы извлекаются и покушался на остаточную исходный материал, требуемый биоконверсии продуктов и побочных продуктов. Соединения не должны быть водорастворимыми, хотя биотрансформаций обычно осуществляются в водной среде, они добавили в небольших количествах, как концентрированные растворы в органических растворителях, таких, как спирты или диметилового sufoxide. В настоящее время работа направлена на адаптацию всей ячейки экрана микротитровальных пластины для того, чтобы уменьшить количество субстрата требуется и свести к минимуму время настройки.

Таким образом, предложение биокатализаторов зеленый альтернативы химии для выполнения некоторых сложных химических превращений, избирательно и эффективно. Дальнейшая работа в этой области направлена на расширение использования этой технологии и инженерия ферментов для определенных приложений.

SUSAN Труесделл

PFIZER, INC

SUSAN Труесделл является заместителем директора в химической R

Авторы

Автор хотел бы хотел бы выразить признательность за вклад Марк Берг, Джим Bouressa, Мария Браун, Майк Бернс, Джим Коли, Джон Cooperider, Альберт Доро, Род Гелдарт, Марк Гуинн, Дон Guzek, Mike Hintz, Эллен Маккормик Руси Линдерман, Пол Мерфи, Чак Понте, Дуг Скалли, Джо Siderewicz, Jeff Sims, Адам Smogowicz, Ричард воск, и Джон Вон.