ФЕРМЕНТОВ DISCOVERY: скрининг, клонирование, РАЗВИТИЕ

Ферменты ответ природы на многих промышленных и экологических проблем. В данной статье подробно последних подходов к открытию фермента и эволюции.

Что же интегральной схемы для компьютеров, биотехнологии делает для химической, медицинской промышленности и окружающей среды. На переднем крае этой технологической революции микробных ферментов - белков, которые играют ключевую роль в метаболических деятельности микроорганизмов и способности к выживанию в различных условиях окружающей среды. Ученые сделали шаги в изоляции и выражения этих ферментов кодирования генов, которые способствуют биокатализаторов химических реакций на устойчивой основе (1-3), а в некоторых случаях биокатализаторов будет заменить жесткий химического вещества в ряде промышленных процессов. Эта возможность выступила с инициативой в научно-сообщество, посвященное открытию фермента и развития.

Из-за ферментов весьма специфические каталитические свойства, только их в небольших количествах, требуемых для выполнения желаемого преобразования, и выход продукта зачастую выше, чем те, которые получены с химической основе маршрутов. , Полученных из возобновляемых ресурсов, они полностью биологически; излишки биомассы могут быть переданы сельскохозяйственные земли, как кондиционер почвы и удобрений. Кроме того, ферменты работы на мягких условиях (часто при комнатной температуре и при нейтральном рН), который является энергосберегающим.

По иронии судьбы, многие из промышленных процессов, в которых ферментов предложит четкие устойчивого преимущества не наблюдается мягких условиях. Поиск ферменты, которые оптимально работать на определенном рН и температуры, а не теряют активности или изменять производительность в присутствии других химических веществ, является трудной задачей. Кроме того, если новых, полезных ферментов была обнаружена, необходимо разработать экономическую схему производства довести эту фермента на рынок.

Ферменты, полученных из природных ресурсов, таких как грибы и бактерии, а затем генной инженерии или молекулярно эволюционировали "в лаборатории, чтобы придать конкретные новые свойства. Новый генетический материал включить в ядро рекомбинантных хост, такие как Aspergillus грибок или бактерии Bacillus (оба используются в пищевой компонент производства), который легко наращивать с помощью брожения. Причина для использования рекомбинантных хостов для обеспечения безопасности продукции (в некоторых изолированных, дикого Хозяева могут производить токсины или патогенные), более высокой чистоты, меньше нежелательных побочных продуктов и благоприятный экономический процесс. Сегодня 95% всех промышленных ферментов сделаны производства генетически модифицированных организмов (ГМО) в замкнутых заводов.

методы открытие фермента

Первый шаг в открытии фермента заключается в определении промышленной эксплуатации фермента условия, стабильность фермента в промышленных решений и личности избирателей, что может негативно сказаться на активности фермента. Другие ключевые параметры включают в себя активность и специфичность фермента. Выбор открытие техники также зависит от зрелости отрасли, для которых фермент будет развиваться. Вопросы можно задать на данный момент включает: Это первый раз ферменты используются в данной отрасли или для этого приложения? Есть ли необходимость в разработке новых ферментов для выполнения желаемых задач, или ферменты с аналогичными возможностями уже доступны? Является ли новый фермент предназначены для повышения производительности существующих продуктов или доставить высочайшей производительности системы, которая включает в себя дополнительные выгоды потребителя? Это, в глубоком понимании промышленного применения (например, в прачечной и процесс выпечки), а также знание основных условий процесса, помогают обеспечить выбор оптимального анализа скрининг на один в процессе ..

Количество фермента подходы открытие может быть применено, в зависимости от конечной цели:

1. "Классической" микробной отбора использованием установленных сбора ДНК из соответствующих штаммов

2. комплексного подхода с участием молекулярного скрининга изолированных микроорганизмов или сложных экологических образца; молекулярного скрининга работает геномики, протеомики и, в сочетании с биоинформатики.

3. молекулярной эволюции или "развивающиеся" структуры белка путем итерационных белковой инженерии.

Классическая микробных скрининга

"Классический" микробной скрининга на основе культивирования широкого разнообразия микроорганизмов. Разнообразие должно быть отражено в таксономии и филогении, а также физиологические, биохимические и экологического многообразия. Хотя скрининг принципиально игра чисел, она позволяет определить гены интерес, при условии, один знает, как на экран, где на экране (4).

Критерии, которые промышленных ферментов должны отвечать должны быть отражены в библиотеке микроорганизмов, скрининг. Так, например, ферментов для моющих средств используются, должны показать оптимальную производительность при высоких значениях рН и температуре 20-50C. С другой стороны, корм ферменты работы на нейтральных значениях рН и 37C (например, температуры окружающего воздуха в кишечнике). Кроме того, корм ферменты должен также доказать, высокая стабильность при высоких температурах, так как они совместно сформулированные с кормом, а при низких значениях рН, так как они, чтобы выжить в желудке.

Секретируемые ферментов, которые производятся extracellularIy бактерий, архей и грибов, наиболее высока вероятность жить до разнообразных и зачастую экстремальных условиях. В отличие от внутриклеточных ферментов, которые часто стабилизировалась в цитоплазме, секретируемых ферментов были оптимизированы для работы в среде путем естественного отбора, так как они развивались в течение тысяч лет. Примеры микробных источников выделяется ферментов щелочной озера с очень высоким значениям рН, кислота весной с низким значением рН, геотермальных области с температурой выше точки кипения воды, и полярных регионах (5).

Задача микробных отбора бесконечное разнообразие форм жизни (4, 6, 7). Однако после того, применение понимание и анализ функциональных скрининга разработана, соответствующие части микробной ДНК может быть в первую очередь проверяются на найти как можно больше положительных просмотров - генов, кодирующих ферменты, которые в соответствии с любым из условий применения - насколько это возможно. Это часто приводит к культуральной жидкости contaning генов, кодирующих более 100 ферментов.

В средней отбора, более строгие тесты-применяются к культуре бульоны. Гена, кодирующего фермент оптимального изолирован от смеси и вставляется в соответствующий хост (например, кишечной палочки и Saccharomyces cerevisiae). Библиотеки (последовательности нуклеотидов в гене) проверяется с использованием тех же теста, которое было применено в первоначальном экране.

В то же время, новые микробного разнообразия может быть идентифицирована путем извлечения, секвенирования (определения порядка нуклеотидов в молекуле ДНК) и усиления (создание нескольких копий) рибосомальной РНК (рРНК) генов микроорганизмов в экологических образца, таких, как почвы, воды или листа. Анализ этого образца может быть добавлена к проверке платформу для фермента интересов.

Чтобы определить гены романа, ученые используют последовательности процедурой, основанной на маркер ген найден в организме. Например, ген 16S является маркером генов во всех видов бактерий. Таким образом, после уборки урожая образца, исследователи выделить 16S рРНК генов бактерий ДНК и последовательность их. Эти последовательности сравниваются друг с другом и 16S рРНК последовательности из известных видов. Если не найти близкое соответствие с существующими 16S рРНК генов, то тестовая последовательность называется, представляют собой новую бактерию. 16S рРНК последовательности также относится к archea. Для грибов, эта последовательность процедура называется 18S рДНК или вмешиваться анализа последовательности (8). Другие быстрые методы секвенирования, такие, как преобразование Фурье ИК-спектроскопии, также могут быть применены (9).

Показ гена библиотеки может быть выполнено на агаре или в микротитровальных пластин, в зависимости от анализа применяется. Жидкие тесты в формате микротитровальных пластины предложить более широкий спектр возможностей, когда речь идет о разработке отбора пробы, тем более, что обследование не зависит от роста соответствующего штамма или клона.

Как правило, библиотеки передаются из агар пластины для микропланшет пластин посредством использования колонии грибов. Эти библиотеки инкубировали расти мастер-банка, и часть культуры передается пипетки робота отбора пластины окончательно определить несколько активных клонов в библиотеке из одного организма. Клонов нашли активно отбора анализируются, и ген вставки для определения последовательности гена, который кодирует экранированного деятельности. Далее, выражение клонов строятся с целью повышения урожайности фермента выражении (рис. 1, бокс, стр. 43). Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Fusarium, Pichia и Hansenula штаммов часто используются для этой цели (11, 12).

Молекулярный скрининг

Функциональные экраны часто дополняются молекулярно-скрининг методы, основанные на сходство между ферментом кодирования последовательностей генов (10). Иными словами, последовательность информацию из множества генов ферментов используется для выявления и клонировать дополнительные гены из других организмов. Выравнивание или нуклеотидных последовательностей или соответствующих аминокислотных последовательностей, после идентификации эволюционно сохраняется регионах, дает возможность для разработки вырожденных полимеразной цепной реакции (ПЦР), грунтовки содержащих ДНК последовательности, соответствующей гомологичной области.

Полимеразной цепной реакции (ПЦР) является метод широко используется в биотехнологии для усиления следовых количеств ДНК. Первый шаг для ПЦР состоит в синтезе "праймеров" или нитей нуклеотидов (примерно 20 макс), которые располагаются в порядке, который дополняет гомологичной областью интересов. По отжига праймерами, специфичными для олигонуклеотидов ДНК и выполнении нескольких раундов репликации режиссер грунтовки, желаемый последовательностях ДНК могут быть усилены в миллионы раз в несколько часов. Ограничения метода является то, что фермент вариантов, но не совсем новых ферментов, обнаружены. Преимущество заключается в том, что этот метод не зависит от ни экспрессии гена в вопросе (как доноров, так и принимающих) или функциональных проб для определения активности фермента. Этот подход может быть также использована для проверки экологической библиотеки, так как активно живых культур не являются обязательным условием. Эти ПЦР праймеры могут быть использованы для усиления и последовательность фрагмента гена гомологичных по выборке из геномной ДНК.

Используя этот метод, начиная только с 4 гомологичных последовательностей генов, ученые клонировали 32 генов роман целлюлозы из целлюлозы семьи 45. Эти 32 представлены все четыре основных грибных таксонов (например, Ascomycota, Зигомицеты, гл tridiomycota \ и Basidiomycota (13)). Эти целлюлозы могут быть использованы для моющих средств, денег, текстильной и целлюлозно-бумажной приложений.

Гена сращивания по перекрытия расширение представляет собой модификацию описанного выше метода с которой конкретные изменения включены в 5'-или 3'-концах пары продуктов ПЦР, что дает возможность каждому поделиться общей последовательности нить рум другой домен. Во время следующего цикла PCR, эти нити пересекаются, таким образом, чтобы общие последовательности концы совпадают. В последующие реакции синтеза, пересекающихся областях, отжиг, образуя один полнометражный молекулы. Этот гибридный белок сохраняет свою активность фермента после клонирования fullopen рамки считывания (ORF; последовательности ДНК или РНК, которые могут быть воплощены в белок), о чем свидетельствует и ксиланазы endoglucanase ферменты (14).

Отбора методов, описанных выше, как правило, доставить фермент кандидатов, которые выполняют хорошо.

целевого приложения. Однако, если производительность пробелы все еще существует, можно рассмотреть следующие варианты: начать новый раунд отбора на основе результатов первого тура или запуска программы оптимизации белка (например, молекулярной эволюции с участием белковой инженерии методы, такие, как случайные или сайта конкретных мутагенеза или перетасовки ДНК).

Альтернативный подход скрининга был описан, где ген библиотеке проверяется на секретируемых ферментов вместо данной функции использованием биохимического анализа (15). Это может быть достигнуто путем immunoscreening, принцип которого заключается в создании антител против всех секретируемых белков в клетке, свободной культуры бульон данного микроба. Затем, ген библиотеке создается из того же организма с помощью вектора экспрессии, которая направляет выражение выделяется белок, кодируемый геном в микробных хозяина. Вектор Адна молекулы, которая воспроизводит сама по себе в клетке-хозяине. Если это небольшой фрагмент ДНК иностранных сращиваются для вектора, то он будет воспроизведен в клетке-хозяине, а также.

Выражение библиотеки, то на экране с антителами для избирательного определения клонов, которые выражают секретируемых белков. 4500 клоны insolens Humicola комплементарной ДНК (кДНК) библиотеки были проверены с помощью этого подхода, в результате 166 первичных показов из которых 83% могут быть подтверждены (15).

Последующие секвенирования клонов и по сравнению с базами данных позволяет уступки белка деятельности. Преимуществом этого метода является быстрое производство целого ряда выражение клонов без использования функциональных анализов отбора, которые позволяют только обнаружения отдельных ферментов.

Метагеномика

Метагеномика или клонировании без обрабатываемых микроорганизмов (те, которые обычно не расти в стандартных лабораторных условиях), представляет собой альтернативный подход фермента скрининга (16-18). Стратегия уже принесла новые доказательства генетических ресурсов, содержащих миллионы неохарактеризованной генов (20, 21). Его элегантность заключается в том, что она не зависит от культивирования микроорганизмов для получения генетического материала, а, скорее, на извлечение ДНК или РНК (мРНК) из многих видов организмов в экологических образца. Клетки этих микробов лизируются использования химических веществ (щелочных условиях) или физические (ультразвуком) методов.

После того как ДНК является свободной, она отделена от остальной части образца с помощью центрифугирования плотности, связывающих или растворимости и выпадения осадков. Ограничение ферменты работают сократить ДНК (обеих нитей) в определенной последовательности пар оснований на более мелкие фрагменты. Эти фрагменты сочетаются с векторов - небольшие подразделения ДНК, которые могут быть вставлены в ячейки для репликации и производства белков, кодируемых ДНК. Векторов также содержат селективного маркера, который дает модель роста организма advntage, что как правило, не имеют (например, устойчивость к антибиотикам частности).

Далее, векторы, содержащие метагеномных ДНК вводится в модель организм, как правило, E.coli, которые выращиваются на селективных средах, так что только клетки, несущие векторы будут выживать, образуя колонии. Образцы клеток, содержащих все метагеномных ДНК, векторы называются метагеномных библиотеки, которые обычно используются для поиска новых форм известных генов. Каждая колония может быть использован для создания фонда клеток для дальнейшего изучения одного фрагмента ДНК из экологических образца.