Дизайн жидкостной хроматографии процесса
Какие соображения необходимы во время ранних стадиях процесса проектирования жидкой хроматографии для обеспечения успешного scaleup?
Жидкостная хроматография является важным шагом в достижении очистки высокой чистоты, необходимой для продуктов крупномасштабных биофармацевтического производства. Однако, в масштабах производства, этот процесс имеет свой набор приоритетов и целей против своих аналитических и лабораторных аналогов. В масштабах производства, изменения техники все чаще используются для разделения биомолекул в сложной смеси на отдельные компоненты для целей анализа или количественные цели, изолировать одного биомолекул и ликвидации загрязнений. Колонка нагрузки намного выше, а потери разрешения из-за перегрузки могут обратиться в пределах приемлемого качества разделения. Информация, представленная здесь, адреса аспекты производства масштаба хроматографии, которые могут помочь пользователям в процессе развития, scaleup и окончательный проект производства масштаба операций.
Компонентов жидкостной хроматографии же, несмотря ни на что тип разделения или масштаба участвует. Стационарной фазы (также называемой сорбента или матрицы), состоит из мелких частиц, которые положительно, отрицательно заряженных или нейтральных, функциональных групп. Подвижной фазы (или элюента), решение, которое несет в себе вещества, перекачивается в стационарной фазы, которая была упакована в колонке, до полного обязательного равновесия.
В некоторых случаях один и подвижных форм фазы смеси с кормом компонентов, в которых составляющие перемещения через колонку с различной скоростью по отношению к подвижной фазе, в зависимости от степени их ионного взаимодействия с матрицей. Этот режим работы называется изократической / элюции шаг или градиентной элюции.
В других случаях компоненты могут связывать так плотно, с сорбентом, что для элюции их состав подвижной фазы должна быть изменена путем увеличения его ионной силы (например, NaCl градиент) или изменить его рН, либо в дискретных шагов ( ступенчатой элюции) или в непрерывном режиме (градиентной элюции) до компонентов интерес начинают двигаться через колонку.
Производство масштаба соображений хроматографии
Многие коммерческие производственные процессы выбирают надежность и низкая стоимость ионообменной хроматографии (IEC) в качестве основного шага. Гидрофобные взаимодействия и размер изоляции (гель-фильтрация) хроматографических стадий (МКХ, сек) часто используются с целью улучшения очистки, но эти методы увеличения числа шагов в рамках общего процесса, который, как правило, нежелательно. Конкретному продукту обязательного техники, таких, как аффинной хроматографии (AC), фиксирует очень разбавленных компонентов из огромного количества загрязняющих веществ, концентратов продукт, и это все в меньшем количестве, чем разделение шаги либо МКХ или сек. В некоторых случаях, AC могут быть использованы только выборочно удалить желаемый продукт молекулы из потока, позволяя при этом загрязняющих веществ, поток через.
Обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (RPLC) использует очень сильные гидрофобных взаимодействий между биологической молекулы лигандов на поддержку хроматографического разделения получить. Элюцию требует высокой концентрации органических растворителей, таких как ацетонитрил или 2-пропанол, которые могут нарушить ферментативной и иммунологической активности белок, тем самым снижая темпов восстановления. Тем не менее, RPLC иногда единственный метод, который может доставить окончательного разделения белков энантиомеров. По сути, этот метод несколько ограничены разделения пептидов, или для управления технологическими процессами.
Преимущество использования RPLC в крупномасштабных операций является то, что он использует короткую колонку с маленьким диаметром, но это эквивалентно тому, что большое количество техники равновесия stages.This требует более капитальных вложений, чем большинство других методов хроматографии и считается когда продукт является чрезвычайно ценной.
Производство масштаба очистки
Для крупномасштабных процессов хроматографии (пилот или производственно-шкале), очистки становится все более сложной задачей. Тем не менее, введение дополнительных мер очистки, например, мембранные увольнений, часто переводит в более высокие потери продукта и снизить общие выхода продукта. Благодаря тщательному подбору среднего и буфера для отдельных шагов хроматографии, а также применение этих мер в нужной последовательности, можно устранить или уменьшить определенные мембранного разделения этапов. Кроме того, расширен кровать адсорбции может быть использована для захвата вниз по течению продукта непосредственно из биореактора бульон, тем самым уменьшая количество ступеней разделения (например, микрофильтрации или центрифугирование) и концентрации продукта / буфер обмена шаги (например, ультрафильтрация), необходимых для очистки продукции.
1 требование, что каждый хроматографический процесс должен отвечать, независимо от масштаба, является достижение равномерного распределения потока через площадь поперечного сечения колонны, от входа к выходу портов, с минимальным смешения и разбавления в потоке распределения камерах либо конец колонны.
Равномерное распределение потока легко достичь с smalldiameter колонны лаборатории, а диаметр увеличивается, так же, как трудно поддерживать равномерный поток. Одним из возможных решений является расщепление потока и распространение его через несколько портов на колонку конце пластин. Но это может затруднить для очистки и шлюз для одного или нескольких портов - проблема, которая может быть трудно обнаружить и исправить. Второй подход заключается в использовании одного порта и распределять поток через систему радиальных ребер врезался в конце пластин. Для большего диаметра колонки, анти-струйная устройство используется для уменьшения и дисперсных ввода высокой скорости потока.
соображения процесса развития
Развитие процесса хроматографии жидкости обычно включает изменение фазы, колонного типа, режим обнаружения и температуры. Условия, используемые в лабораторных отличаются от тех, которые используются в экспериментальных и производственных масштабах экспериментов. Таким образом, важно предвидеть крупномасштабных технологических условий и ограничений на ранних стадиях проектирования системы, с тем чтобы уменьшить проб и ошибок (например, тестирование растворителях с различными типами колонн до оптимального разделения достигается). Она играет ключевую роль не только для получения наилучшего разделения, а также обеспечить, что метод не чувствителен к небольшим изменениям в подвижной фазы состава.
Факторов, которые играют ключевую роль в этом процессе проектирования включают следующее:
* Характер мобильных и стационарных фаз, очистка техники и типов буферов
* Объем кровать и высоты, а емкости колонки (молекулярная нагрузок для поглощающего продукта и загрязняющих веществ)
* Скорость подвижной фазы, перепада давления, диаметр колонны и в результате расход
* Объем продукции в партии, чтобы быть обработаны
* Методология колонке мойки, регенерации и уравновешивания связанных с объемов жидкости.
Рассмотрение этих факторов при разработке методики проектирования обсуждается ниже.
Выбор правильного мобильных и стационарных фаз может включать предварительный опыт или использования пакетов программного обеспечения, таких, как отправная точка (Perkin-Elmer программы включены в "LC аналитик Система"), которая предусматривает шаг за шагом руководство по мобильным -фазы и столбцов выбора. Также доступна Сухой Lab, программные средства, сделанные LC Resources, Inc, которая калибрует подвижной фазы составов дать оптимального разделения.
Выбор режима обнаружения зависит от характеристик образца. Некоторые из доступных режимов включают ультрафиолетовые, показатель преломления и флуоресценции.
Развитие широкого спектра адсорбентов, которые подходят для разделения белков - например, гель-фильтрации информации, иониты, обращенно-фазовой упаковки, гидрофобные адсорбенты взаимодействия и адсорбентов аффинной хроматографии - вызвал рост промышленного хроматографии в колонках с постели объемы в несколько сот литров. Для многих хроматографических методов в настоящее время доступны, смолы выбор регулируется вопрос: при каких условиях может быть специфический белок связан? Другие соображения носят долгосрочный сорбента наличие или файл над наркотиками (DMF) имеющиеся. (DMF это процедура, которая защищает интеллектуальную собственность производителя активного вещества, позволяя при этом уполномоченных лиц на доступ к информации, необходимой для оценки применения активного вещества в лекарственное средство.)
Пользователь должен проводить испытания применимости среды для предполагаемого разделения. Media производители могут предоставлять подробную документацию по вопросам безопасности и производительности конкретного сорбента. Тем не менее, сорбентов, в среднем грузоподъемности для обычных белков могут отличаться от фактических возможностей продукта показал в тестах.
После того как компоненты системы были выбраны, хроматографические условия должны быть оптимизированы. Это может включать предварительный анализ, чтобы определить, является ли компонент сохранить или вымывают колонны, и является ли оно будет обнаружено. Такой анализ может включать в себя 10-минутной линейным градиентом запустить с помощью двух отдельных решений подвижной фазе в концентрации 10% до 100%. Ученый оптимизирует обязательным и элюции целевой компонент для достижения высокой производительности и предотвращения продукт разворачиваются, осадка, окислительного и т.д.
Мобильный фазового состава могут быть оптимизированы с помощью таких систем, как Перкин-Элмер растворителей Оптимизация системы (песо), который автоматически изменяет подвижной фазы состава для достижения наилучшего разделения. В IEC, рН карты часто готовы найти оптимальные условия разделения. Моделирование программного обеспечения могут предложить алгоритмы, основанные на фактических экспериментов, которые предсказывают очищения [для некоторых систем] в "новых" условиях.
методы градиента элюции часто используются на ранних разработках. Но, в производственном масштабе процессы часто используют изократической элюции. Результаты экспериментов с использованием методов градиента элюции служить основой для планирования экспериментальных опытов.
Температура колонки могут оказывать положительное или отрицательное воздействие на процесс хроматографии, влияющих на ионные взаимодействия адсорбента и жидкостей. Например, повышение температуры окружающей среды выше условий может уменьшить время выполнения, но снижения эффективности разделения. Новые хроматографической информации может облегчить эту задачу за счет более определенных обязательных возможностей и значительно более коротким временем очистки стало возможным благодаря использованию высоких скоростей жидкости. После того, требуемого разделения получается, диод детекторов могут быть использованы для определения длины волны максимума поглощения каждого пика и, следовательно, оптимальную температуру процесса.
Оборудование выбор материала диктуется условий технологического процесса. В большинстве случаев. Тип 316L нержавеющая сталь, стекло (боросиликатное), а также некоторых полимеров и эластомеров (например, EPDM или Kalrez) используются для обеспечения хорошей совместимости материалов и стабильности. Тем не менее, буферы содержащих хлорид-ионов не могут быть совместимы с нержавеющей стали. Металлические элементы, которые находятся в контакте с буферами с высоким содержанием хлорид-ионов могут быть изготовлены из Hastelloy C или титана.
Проверка метода, разработанного для жидкого процесса проектирования хроматографии необходимо, чтобы гарантировать соответствие критериям для использования по назначению. Типичные критериев, учитываемых при проверке точности метода, точность, линейность, специфичность, предел обнаружения и количественного ограничения. В большинстве случаев проверка метода необходимо лишь продемонстрировал один раз.
Как только метод или система была утверждена, она должна быть регулярно проверяться с целью обеспечения того, чтобы он выполняет в рамках одобренных лимитов. Простейшая форма пригодность тест-системы ВЭЖХ предполагает сравнения хроматограмм след со стандартным следа. Это позволяет проводить анализ пика формы, ширина пика и базовым разрешением.
BOB DREAM является директором фармацевтической биотехнологии для CH2M-Hill, Inc (10123 альянс Road, Suite 300; Cincinnati, OH 45242, телефон: (513) 587-7143, факс: (513) 530-5541, E-почта: < HREF = "mailto: ch2m.com robert.dream @"> robert.dream @ <ch2m.com />). Dream имеет 24 лет опыта в промышленном процессе планирования, цикл времени анализ, scaleup, соблюдения нормативных требований и управления активами. Он является известным оратором состоянии дел в области биотехнологии и фармацевтической процесса проектирования, чьи работы широко опубликованы. Dream профессиональный инженер и является активным членом международного Soc. фармацевтической инженеров (МНПП).
