Рекомбинантного белка терапии с СНО Cells - 20 лет и счетная

Ячейки СНО в самом разгаре технологических известность благодаря своей приспособляемости к различным условиям культуры и пластичности в контексте генетических изменений. В дальнейших исследований, применение стратегии ячейку культуры, основанной на научных рассуждений, а не эвристики, в не столь отдаленном будущем.

терапии рекомбинантного белка изменили лицо современной медицины в последние десятилетия, и они продолжают оказывать новаторских и эффективных методов лечения многочисленных болезней, ранее тугоплавких. Сегодня они используются в лечении целого ряда заболеваний человека, начиная от рака к бесплодию. Эти белки, как правило, синтезированные на широкомасштабное культивирование генетически модифицированных "хозяина" клетки, которые искусственно гавани трансфекции генов, кодирующих белки интересов. Для белка терапия была эффективной, они должны быть синтезированы в биологически активные формы, требующие надлежащего складные и пост-поступательные изменения. Во многих случаях это включает гликозилирование, типа, когда определенные изменения углеводного фрагменты добавляются к конкретным аминокислотных остатков белка.

Гликопротеины, как это обычно называют, как правило, синтезированные в клетках млекопитающих, так как общее микробное Саваоф, как кишечной палочки отсутствие необходимых механизмов для синтеза соответствующих glycoforms. Некоторые грызунов или человека клеток, полученных как 3T3, СНО, ВНК, НеЬа и HepG2 часто используются в биомедицинских исследованиях для гетерологичных выражение белка. Несмотря на наличие полноты клеточных линий, почти 70% всех рекомбинантных белков терапии, производимых сегодня, сделаны по-китайски Hamster яичников (CHO) клеток. Текущий годовой объем продаж на biologies, полученные с использованием клеток СНО только превышать 30 миллиардов долларов США по всему миру.

Первый рекомбинантных терапевтических белок в клетках млекопитающих, тканевого активатора плазминогена (т-т в год, Activase) синтезированы с использованием клеток СНО, был одобрен для клинического использования в 1987 году. Это ознаменовало начало массива успешных СНО основе терапии (см. таблицу), которые продолжают революцию в области медицины и по сей день. Знаний и опыта, накопленного в течение последних двух десятилетий наверняка обеспечить СНО клетки продолжают оставаться премьером лошадкой промышленности для производства терапевтических протеинов, по крайней мере в ближайшем будущем.

В этой статье мы вернемся к эволюции клеток СНО, отслеживание от их происхождения для развития текущих клеточных линий производства, и обсудить некоторые важные аспекты, которые делают их надежность и гибкость хостов экспрессии белков. В отличие от некоторых своих родственников грызунов (мышей и крыс), генерация геномных ресурсов для китайских хомяков было весьма ограниченным. Геномика и протеомных инструментов, использующих эти ресурсы потенциально могут помочь в понимании и совершенствовании производства рекомбинантных белков процессы, приводящие к значительным улучшением в скорости, с которой эти терапии переход от лаборатории молекул к спасающим жизнь лекарствам. Поэтому мы особое внимание на важность и необходимость в такой информации в решении задач будущих исследований и производственных процессов.

От хомяка в тканевых культурах

Китайских хомяков впервые были использованы в качестве лабораторного образца в 1919 году вместо мыши для ввода пневмококков (Box). Последующие усилия по приручению д-р Джордж Yerganian и др. в середине двадцатого века привело к развитию спонтанного наследственных заболеваний из-за инбридинга, стимулирование исследований интерес к генетике хомяка (2, 2). Было отмечено, в то время, что небольшое число хромосом китайских хомяков (2n = 22), делает их особенно полезными моделями в области радиационной цитогенетики и исследования культуры тканей. В 1957 году при исследовании полезности различных соматических клеток в генетике клетки, д-р Теодор Т. шайба из кафедра медицины в университете штата Колорадо выделили из яичника китайского хомяка женщин и установили клетки в культуре пластин (3) . Очень скоро стало очевидно, что эти клетки были довольно устойчивыми и легко поддаются в пробирке культивирования с относительно быстрые сроки поколения. Кариотип неоднородности среди этих клеточных популяций вызвали особый интерес в контексте изучения хромосомных аномалий ..

Вклад основных медико-биологических исследований

До поздней части двадцатого века, выделение и характеристика млекопитающих мутантов ячейки для цитогенетических исследований является сложной задачей, чреватой неудач, потому что, в отличие от микробов, клеток млекопитающих, как правило, диплоидными. Создание клеток СНО в культурах тканей позволил ученым преодолеть эту трудность, так как эти клетки функционально hemizygous для многих генов, в первую очередь за счет инактивации гена (4, 5). СНО клетки впоследствии были использованы в многочисленных биомедицинских исследований, начиная с анализа посредника обмена веществ и клеточного цикла в токсикологических исследованиях, настолько, что они были названы в качестве млекопитающих эквивалентно модели бактерии кишечной палочки (6).

Среди исторически важных медицинских и клеточной биологии, исследований, проведенных в СНО, это было ранней работы, связанной с мутагенеза этих клеток и выделение определенных ауксотрофов (7), что способствовало их миграции из лабораторных стендов для промышленных реакторов. Эти мутанты выставлены частности потребности в питании для поддержания роста и жизнеспособности в течение длительного периода культуры. Мутанты с различной степенью недостатков в метаболических ферментов, как аденин phosphoribosyl трансферазы (Апрт) и дигидрофолат редуктазы (DHFR) были изолированы таким образом (8, 9). Кроме того, мутантов дефектные в транскрипции, трансляции и механизмов для некоторых аминокислот и полиаминов биосинтеза были изолированы (10-14).

Хотя основной мотив изоляции этих мутантов была фундаментальных исследований, он был, может быть, случайно, что потребности в питании ауксотрофов можно было бы использовать для выбора клеток, экспрессирующих экзогенных белков. Система DHFR выражения, которые будут обсуждаться в последующих разделах, теперь является стандартным инструментом для молекулярных биологов требующих вектор-опосредованного переноса генов в клетки СНО. Эта способность перемещение, выбор, усиливать, и стабильно выразить биологически активных гетерологичных белков вскоре стал огромным благом для биофармацевтических компаний, вовлеченных в бизнес крупных терапевтических белков синтеза.

Огромные адаптивные способности клеток СНО и простота в обслуживании которых эксплуатируется во многих областях фундаментальных биомедицинских исследований. G-белками рецепторы и связанные с ними сигнальных путей класса молекул часто изучали стабильной выражение в клетках СНО, внося вклад в стационарном лечении в области анестезиологии, фармакологии и основных сотовых исследований сигнализации, а также (25-17). Крепления зависит от характеристик клеток СНО сделать их полезными моделями для понимания и микротрубочек цитоскелета структура, сцепление с дорогой и подвижность, что способствует распространению знаний в управление, биологии рака и лечения (18,19). СНО клетки также являются относительно легко синхронизировать, что делает их идеальными моделями для исследования клеточного цикла (20).

Повреждения ДНК и ремонт другой области, где СНО клеток широко используются. Мутанты недостатки в doublestranded ремонт разрыв ДНК были выделены и изучены в репарации ДНК и радиационных исследований (21, 22). СНО клеток используются также в других токсикологии и исследования наркомании, которые несложно высокой пропускной биомолекулярных систем скрининга. Некоторые недавние исследования в связи с этим были связаны с анализом последствий кофеина (23), пестицидов (24), а также различных терапий, используемых при лечении рака (25) на клетки млекопитающих.

СНО клеток рекомбинантных ДНК хостов

Выбор клетки хозяина для экспрессии белка имеет огромное влияние на характеристики продукта и максимально достижимой доходности. Сворачивании белков и пост-поступательных изменений предоставляемых хозяев диктовать phamacokinetic и фармакодинамические свойства продуктов и, следовательно, их растворимость, стабильность, биологической активности и времени пребывания людей. Безопасность товара является еще одним ключевым аспектом, который следует учитывать при выборе клеток хозяина. Производства принимающей не должны допустить распространения любого случайного патогенных агентов, которые могут в конечном итоге попадают в людей. Из промышленных точки зрения, способность к адаптации и роста клеток в суспензии, а не сторонник культуры весьма желательно, так как позволяет объемная масштабируемость и использования больших биореакторах перемешивают с танками. Наконец, клетки хозяина должен поддаваться генетические модификации, позволяющие легко внедрения чужеродной ДНК и экспрессия большого количества желаемых белка.

Двадцатилетний опыт с клетками СНО в биофармацевтической промышленности показала, что в значительной степени, они обладают многие из этих характеристик. СНО клетки доказали свою композицию для производства белков с glycoforms, которые являются одновременно совместимыми и биологически активных людей. Они также продемонстрировали, как безопасное хостов для синтеза biologies. Одна из первых проблем в рекомбинантного белка в том, что культурный клетках млекопитающих предположительно были определены на основе возмущения онкогенов и, таким образом, могут распространяться без последствий старения. Тем не менее, CHO клетки, как было доказано безопасной, стоимость продукции генерируется значительно перевешивает любые возможные риски.

Вниз по течению процессов СНО клеточных продуктов созрели до такой стадии, когда они могут быть очищены, чтобы содержать не более пикограмма уровни загрязняющих СНО ДНК на дозы продукта (26). Кроме того, исследование, проведенное в 1989 нашел, что из 44 человека патогенные вирусы тестирования, подавляющее большинство из них, включая ВИЧ, гриппа, полиомиелита, герпеса, кори и не повторить в СНО (27). С точки зрения нормативной, CHO клетки выдержали испытание временем. Всестороннее тестирование и безопасности данных, накопленных в течение двух десятилетий промышленного производства, несомненно, облегчит процесс достижения одобрение FDA для производства новых СНО основе терапии.

Но, пожалуй, наиболее важные факторы, которые позволили принять клеток СНО, как рабочая лошадка в отрасли являются их гибкость и легкость их генетических манипуляций. СНО клеток достаточно гибкой и может вырасти до очень высокой плотности в суспензионных культурах, которые легко масштабируются до> 10,0000-L биореакторы. Кроме того, изоляция клеток недостаточной активности ферментов DHFR привело к эффективным средством для выбора стабильных клонов и усиления генов, тем самым существенно увеличивая конкретные уровни производительности.

DHFR небольшой мономерных фермент, который катализирует превращение фолиевой кислоты, витамина общих для tetrahydrofolate (THF). Последний сомножитель перевозчика за 1-углеродных фрагментов требуется в различных биосинтетических реакций, в частности синтеза глицина, пуриновых и тимидина. В пионерской работе в начале 1980-х годов Chasin и сотрудники изолированных DHFR 2-дефицитных мутантов (DXBIl и DG44), которые обычно используются в качестве родительских линий клеток сегодня (9, 28, 29). Оба эти производные пролина требующих auxotroph установленном Као и шайба в 1968 году (30).

С DHFR-дефицитных клеток тройные ауксотрофов для. глицин, гипоксантин (пуриновые производные) и тимидина, внедрение гетерологичных генов в клетках может быть достигнуто путем трансфекции совместно с функциональной копией гена DHFR, которая устраняет необходимость в этих веществ. Клональный выбор Затем выполняется ростом в средствах массовой информации лишенной глицина, гипоксантин и тимидина. Система также позволяет DHFR эффективного усиления клонированных ДНК. При культивировании в высоких уровнях метотрексата (MTX), фолиевой кислоты, что аналоговые блоки DHFR деятельности, трансфекции клеток должны справиться со снижением активности DHFR. Само присутствие экзогенных генов DHFR недостаточно для выживания в этих условиях, скорее, повышенной экспрессии DHFR является оправданным и выживших клеток имеют вероятность усиливается копию число DHFR локуса решения этой задачи. Генетической связи между DHFR и трансфекции генов проценты, гарантирует, что трансгена является также одним из усиливается, повышая тем самым шансы на получение высокого напряжение производства ..

Текущая стратегия развития СНО клеточной линии

Обычно используемые стратегии для получения highproducing линии СНО клетки родительских линий с использованием DHFR системы отбора, хотя и создан, довольно трудоемкий и кропотливый. Рисунок 1 является представителем иллюстрации типичных этапов в развитии производства клеточной линии. Это не редкость для этого процесса потребуется более 6 месяцев в промышленной установки для каждого нового кандидата терапевтических даже прежде чем она сможет вступить оценки фазу, когда молекулы проверяется на его эффективность и безопасность в животное / человека в качестве субъекта.

Первый шаг в развитии производства клеточной линии является поставка рекомбинантных ДНК в ядре клетки-хозяина для хромосомных интеграции (Этап I). Некоторые методы, такие как фосфат кальция осадков, электропорации, lipofection и rerroviral трансфекции, которые обычно используются с оптимизированным протоколы, доступные в литературе. После того как ДНК попадает в ядро, интеграция сайта вектора является случайным, и выражение трансгена является, в частности, продиктовано окружающих хромосомные структуры и связанных с ними возможностей. Высокая активность транскрипционных крайне желательно на локус ДНК интеграции. Различные стратегии были попытки улучшить частоту выделения клонов, которые интегрированы на гены транскрипционно активных сайтов. Например, мутантный ген DHFR с пониженной ферментативной активностью гена или DHFR приводится в движение слабым промоутер иногда используется как более жесткие выбор ведет к повышению экспрессии трансгена. Другие стратегии включают в себя использование хроматина открытия элементов, таких как леса или матрицы вложения регионов (S / МАРС) (32) и повсеместное открытие элементов хроматина (УКО) (32) в векторной ДНК, которые способствуют доступность ДНК для транскрипции на интеграцию сайта. .

После доставки ДНК, бассейн клеток стабильно выразил совместно трансфекции DHFR фермента выбираются с помощью низких уровнях MTX и выращивания в условиях отсутствия глицин, гипоксантин и тимидина (шаг 2). Дополнительные средства выбора, такие как антибиотики (например, гигромицину) могут быть использованы в случае необходимости маркеры сопротивление включены в векторе. На данном этапе большинство клеток, из которых не был успешно интегрировать векторной ДНК убиты, а выживших клеток, по-видимому выражения протеина интереса, в конечном итоге восстановить (Шаг 3). Далее, этот пул клеток, подвергшихся воздействию высоких концентраций MTX (как правило, возрос более 0,5-1 м). Этот шаг, как правило, называют усиление (Шаг 4), что значительно увеличивает давление отбора. Для того чтобы выжить, CHO клетки обычно проходят геномных перестроек и усиления локус ДНК, интеграция в результате увеличения числа копий для DHFR и протеин интереса. Часто клонов, содержащих несколько сотен экземпляров этого вектора построить можно найти следующие усиления ..

В большинстве случаев, этот шаг ведет к изоляции пула клеток обогащенный для клонов с высокой удельной производительности. Это бассейн, однако, является гетерогенной, содержащие клетки с различных сайтов интеграции, копировать номера и различные конкретные продуктивности. Индивидуальные клонов с максимально возможной производительности труда и темпов роста, и самое лучшее качество продукции должны быть изолированы. Это достигается за счет ряда предельных разведений в мульти-и пластин (шаг 5), так что одной колонии с равномерной клеточных популяций могут быть изолированы. Как правило, большое количество (несколько сотен), проверяются выделить небольшое число (-10-30) кандидата производственных линий клеток.

Выбрали клоны будут расширены через несколько выстрелов из пассажей (Шаг 6), и каждый сделал оценивается в лабораторном биореакторов в условиях имитации которыми приходится сталкиваться в крупномасштабных производственных мощностей (шаг 7). После оценки ключевых параметров, одной клеточной линии производства выбирается и накренился, как замороженные флаконы для будущего использования (Шаг 8). В этой камере линии впоследствии используется для создания материалов для клинических испытаний и, в случае успеха, в конце концов, занятых в коммерческое производство.

Достижения клеточных технологий культуры

Одна из основных проблем в использовании СНО и других клеточных линий млекопитающих, как рекомбинантных белков хостов производства является то, что объемный выход белка, произведенного из процессов, использующих эти клетки являются относительно низкими. Производительность млекопитающих культуре клеток процессов, как правило, ~ 10 100 раз меньше, чем можно достичь с помощью микробных хост-систем. Это обуславливает необходимость строительства и обслуживания очень больших и дорогостоящих производственных мощностей. За последние два десятилетия, биофармацевтической промышленности в значительной степени удалось удовлетворить растущий спрос на млекопитающих ячейке на основе терапии путем выбора лучшего производства клеточных линий и оптимизация культуры стратегии для повышения урожайности, в отличие от линейного расширения объемов культуры.

Рисунок 2 показывает значительные улучшения в млекопитающих технологии клеточной культуры на протяжении последних двух десятилетий. Многие из первых процессов проводились в простых режимах партии, длительностью около 7 дней. Сотовый концентрации обычно достиг 3x10 ^ 6 ^ SUP клеток / мл и окончательного титры -100 мг / л считается разумным. В настоящее время большинство процессов используют fedbatch культур, которое позволяет иметь более высокую плотность клеток и дольше продолжительность культуры (обычно 10-12 дней) при добавлении концентрированной среды по всей культуры пополнить обедненного питательных веществ. Совершенствование отбора и развития клеточной линии, а также средних и оптимизацию процесса контроля и управления также внесли вклад в расширение конкретных уровней производительности достигнуто сегодня. В настоящее время окончательные титры продукта на 1-5 г / л обычно реализованы.

Задачи на будущее

Несмотря на значительные успехи, текущее парадигмы развития клеток линии по-прежнему в значительной степени эмпирический характер. Существует значительная степень изменчивости и очень мало понимания источников изменчивости млекопитающих процессов клеточной культуры. В отсутствие каких-либо значительных понимание основных цитогенетических событий сопровождающих развитие клеточной линии, кропотливой и обширной отбора клонов, часто охватывает в течение нескольких месяцев, по-прежнему широко практикуется в промышленности.

Таким образом, каждый новый кандидат терапевтические потребности специальная группа ученых, в целях развития, характеристика и оптимизация принципиально нового процесса. Это особенно проблематично в наращивании масштабов, поскольку Есть нет надежных методов прогнозирования и моделирования характеристик и роста производственного потенциала клеточных клонов в крупных биореакторы. Клонов отобраны и характеризуется в настольные реакторы не могут вести себя подобным образом в больших масштабах в биореакторах, несмотря на, казалось бы, идентичные использованием параметров процесса.

Эти трудности в основном проистекают из нашего недостаточного понимания биологии и физиологии клетки млекопитающих. На следующем этапе развития должны, таким образом, направлены на исследование основных механизмов, ведущих к созданию клонов производить большое количество хорошего качества продукции. Важно ключи уже появились и некоторые стратегии были использованы для инженера клеток повышения производительности труда (33).

Жизнеспособность клеток может быть значительно повышена путем ограничения лактата производства в области культуры. Были предприняты усилия, чтобы инженер путей энергетического метаболизма в СНО для достижения этого эффекта (34-36). Другие усилия, пытались понять механизмы клеточного цикла и определить потенциальные спусковые крючки для апоптоза и гибели клеток (37,38). С гетерологичных белка места чрезмерных напряжений на клетки хозяина, некоторые исследования были сосредоточены на последствиях крупномасштабного производства белка клетки-хозяина машины (развернул белка ответ). Липидного обмена и мембранных биогенеза еще одна область, которая вызвала интерес, так как мембрана текучести кадров в белок секретирующих клеток, вероятно, будет достаточно высокой (39). Для повышения качества продукции, в некоторых исследованиях использовали техники гликозилирования ферментов, при случае эритропоэтина быть хорошо документированы (40).

Успех этих подходов может быть существенно усовершенствованы с помощью использования власти в области геномики и протеомики-технологий. Эти технологии, в первую очередь на основе ДНК микрочипов и платформ масс-спектрометрии и обеспечить возможность заглянуть в молекулярных механизмов, модулирующих клеточный ответ на генетических и экологических преобразований. С помощью этих инструментов, исследователь может профиль уровня экспрессии тысяч генов в одном эксперименте, и сравнить ряд условий, возникших в ходе развития клеток линии. С помощью этих инструментов, исследователи выявили ключевые гены, участвующих в апоптозе контроля жизнеспособности ячейки СНО в fedbatch культур (41).

Сотовый изменения, связанные с повышением производительности труда в СНО клетки были зондируемой использованием 2-D электрофореза геля и масс-спектрометрии (42). Воздействия низких температур на протеома профиля и белка производительности были проанализированы в другом исследовании (43). Эти и другие подобные исследования должны обеспечить будущим исследователям с потенциальными мишенями ген, которым можно манипулировать в целях повышения производительности и роста клеток. Bioinformatic инструменты для анализа данных, полученных из этих экспериментов, чтобы определить экспрессию генов и генных структур-черта отношений, быстро созревания.

СНО проект генома

Вехой завершения проекта человеческого генома, в 2001 году, ускорила открытие человеческого маркеров заболеваний и лекарственных мишеней для лечения многих хронических заболеваний, начиная от рака до болезни Альцгеймера. Последующие секвенирование геномов млекопитающих, другие, как мыши, собаки и крысы, которые являются общими лабораторные модели, еще больше позволили ученым для выполнения медико-биологических исследований и генетического анализа с использованием этих организмов с гораздо большей эффективностью. Хотя многие другие организмы, медицинских, экологических и сельскохозяйственных значение в настоящее время в очереди, чтобы быть полностью секвенированы (<a target="_blank" href="http://www.genome.gov/10002154" rel="nofollow"> WWW .genome.gov/10002154 </ A>), то вызывает удивление, что китайская хомяка среди них нет.

Истории успеха, мыши, крысы и человека геномов убедительной мотивации для проведения аналогичных усилий для китайского хомячка. Обещания молекулярные методы, такие, как микрочипы с высокой пропускной протеомики, количественный ПЦР в реальном времени и РНК-интерференции, может быть реализовано в полной мере только тогда, когда полной последовательности генома, или, по крайней мере, ген-кодов и нормативных элементов последовательностей в организме имеются. Благодаря совместным усилиям между Университетом штата Миннесота и биотехнологической технологический институт Сингапура (* STAR), усилия по обеспечению геномики, протеомики и других OMIC-технологии на основе клеточной инженерии культуры было начато в 2002 году. КДНК основе микрочипов с более чем 4000 различных последовательностей СНО была создана в 2004 году (44). На начальном этапе работы исследователи убеждены, что китайские хомяка достаточно отличие от мышей и крыс, так что мат геномной инструментов, разработанных для этих грызунов, не являются непосредственно применимыми для исследования экспрессии генов изменения в китайских хомяков с использованием методов межвидовых анализа.

Это способствовало усилия для получения более полной ресурсы и расширить последовательность усилий. В партнерстве с Обществом инженеров биологическом (SBE), консорциум по яичников китайского хомячка Сотовый Геномика была основана в 2006 году. В настоящее время восемь корпоративных партнеров из фармацевтической и биотехнологической промышленности, образуют ядро этого консорциума, и их число растет. В один и полтора года с момента его создания консорциума значительно ускорило развитие СНО геномной ресурсы ..

В общей сложности, более 80000 экологически безопасных технологий (выраженная последовательность тегов, по сути РНК с полиА хвостов) были собраны последовательности и в более чем 27 тысяч уникальных непересекающихся последовательностей, и были использованы для создания как Affymetrix и кДНК микрочипов платформ транскриптом профилирования. Продолжающиеся усилия последовательности, используя как традиционные и новые технологии секвенирования сосредоточены на создании более открытой рамки считывания последовательности для переведенных белков, а также вверх и нормативных регионов все более важным "некодирующих" областей генома (например, микроРНК). Последовательностей, которым был присвоен на основе их гомологии с другими грызунами или человеческой последовательности (с использованием баз данных, как GenBank, Ensembl, ФАНТОМ т.д.). Это позволяет ученым задействовать огромные ресурсы, мыши, крысы и человека данных для лучшего анализа экспрессии генов изменения в СНО.

Например, отображение СНО ЭБТ и аннотированный геномов (например, мыши, человека и крысы) транскриптом профиль клеток СНО в различных условиях культура может быть представлена на обменные карты, созданные для других видов. Кроме того, в хромосоме отображений для мыши, человека, крысы и собаки также были проведены (45). В процессе эволюции, геномных последовательностей переставить, но не совсем случайным образом, а, скорее, крупные куски хромосом переехал вместе, образуя новые хромосомы, повторно ассортимент этих сегментов. В рамках каждой большой сегмент, порядок генов в значительной степени сохранились. Зная, каких регионах сохраняются между китайскими хомяков и мышей (то есть, иметь "синтении"), можно сделать обоснованные предположения о структуре и содержании unsequenced областях, лежащих между любыми двумя соседними последовательности локусов. На рисунке 3 показана регионов сохранения китайских хомяков и мышей хромосом выявлены на основе EST секвенирования генома и выравнивание.

За последние несколько лет произошло более широкое использование протеомика и геномика инструменты для культуры клеток биопереработки исследований. Оба ДНК-микрочипов и количественных протеомных инструменты, такие, 2D электрофореза геля и iTRAQ, были использованы для изучения генов, связанных с повышенной производительностью. Микрочипов СНО ДНК создан консорциум начал предоставлять своим членам возможность применить транскриптом анализа различных СНО производственных линий. Вопрос первостепенной важности является: "Можем ли мы определить генетические маркеры, связанные с высокой производительностью?" В соответствующем контексте будет интересно проанализировать, как СНО клеток, которые не выделяют какой-либо значительное количество белков, естественно, получил чрезвычайные секреторных возможностей, которые соперничали профессиональных secretors в нашем теле, как плазма или клеток печени.

Другое потенциальное применение микрочипов является анализ процесса изменчивости. Транскриптом анализ с помощью ДНК-микрочипов, вероятно, являются наиболее доступными OMIC-инструмент. Ни один другой метод может быть применен так быстро всестороннего обследования уровня многочисленных переменных. Хотя поколения таких данных является довольно обычной, систематической инструментов, которые могут напрямую соединит транскриптом данных с физиологией все еще находятся в зачаточном состоянии. Тем не менее, транскриптом анализ может установить процесс отпечатки пальцев для изготовления проходит. Производство работает идеально повторение "того же" процесс каждый раз, в промышленности, однако в действительности эти-видимому, "то же" процессы редко предоставляют идентичные качества продукта и титров. Когда схемы мониторинга процесса не могут определить причину этого отклонения, изменения в транскриптом профили могут предоставить диагностическую информацию. После достаточно большого количества данных накапливается, процессы могут быть классифицированы по определенным критериям (например, окончательный производительности) и сравнение транскриптом данные из этих процессов могут быть определены классы молекулярных подписей определения каждого класса.

Заключительные замечания

Полвека спустя после своего создания в качестве клеточной линии и два десятилетия после ее принесли первые млекопитающих рекомбинантных терапевтических белков для клинического применения, в клетке СНО в самом разгаре экономического и технологического известность, что никто не мог себе представить. Его замечательная приспособляемость к различным условиям культуры и огромной пластичности в контексте генетических изменений вклад в ее универсальности. Несмотря на свою важность, точные генетические основы для этого универсальность еще недостаточно изучена. С согласованные усилия, геномных ресурсов для СНО клетки расширяется. Эти геномных ресурсов в сочетании с системным подходам биологии вносят существенный вклад в наше понимание генетической основы сложных признаков высокой производительности и высокого качества продукции. Это, несомненно, ускорит продукта и процедур процесса разработки. Можно представить себе применение стратегии по культуре клеток, в не столь далеком будущем, где развитие новых процессов терапии и будет руководствоваться в значительной степени в соответствии с принципами научного мышления, а не эвристика ..

ЛИТЕРАТУРА

1. Yerganian, G "" биологии и генетики китайского хомячка, "_Molecular Сотовый генетики. Иоанна Wiiey

2. Yerganian Г., патологии Хомяки, "Prog. Exp. Опухоль Рез. Рекс., Базель, с. 2-41 (1972).

3. Tjio, J. IL, и TT шайба ", генетики соматических клеток млекопитающих. II. Хромосомные конституции клеток в культуре тканей," J. Exp. Знакомьтесь., 108 (2), с. 259-268 (1958).

4. Chasin, Л. и Г. Urlaub ", хромосомы всей событие сопровождает выражение рецессивных мутаций в клетках telraploid" Наука, 187141811. с. 1091-1093 (1975).

5. Симон, А. Е. и др.. "Модель с участием гена инактивации поколения авто сомный рецессивных muianis в клетках млекопитающих в культуре", мол. Сотовый биологии., 2 (9), с. 1126-1133 (1982).

6. Puck, TT, "Развитие китайской яичника хомяка (СНО) ячейки," Молекулярная генетика сотовых. John Wiley

7. Puck, TT и FT Као, "Генетика соматических клеток млекопитающих. V. Лечение с 5-bromodeoxy ундина ами видимого света для изоляции питательной недостаточности мутантов". Тр. Натл. Акад. Sci., США, 58 (3). с. 1227-1234 (1967).

8. Тейлор, МВт, и др.. ", Пурин мутантов линий клеток млекопитающих: III. Контроль биосинтеза пурина аденин в phosphoribosyl мутантов трансферазы СНО клетки", соматических клеток генов., 3 (2), с. 195-206 (1977) .

9. Urlaub Г. Л. Chasin, "Выделение китайских мутантов клетка хомяка недостатки в деятельности дигидрофолат редуктазы," Proc. Натл. Акад. Наука США. 77 (7), с. 4216-4220 (1980).

10. Адэр, ГМ и И. Карвер, "Неустойчивые, не мутационные выражение сопротивления тимидина аналог, trifluorothymitline в клетках СНО". Mutat. Рез., 60 (2). с. 207-213 (1979).

11. Чен, В. Л. и др. /. ", Млекопитающих клетки с измененной формы РНК-полимеразы II." Тр. Натл., Изд. Sci., США, 69 (11), с. 3119-123 (1972).

12. Goktfarb, PS, и др.. ", Изоляции и характеризации аспарагин мутантов клеток китайского хомячка", Exp. Cell. Рез., 104 (2). с. 357-367 (1977).

13. Томпсон, ЛГ, и др.. ", Млекопитающих ячейки мутанта термочувствительных лейцил-транспортная РНК синтетазы". Тр. Натл. Акад. Наука США, 70 (11), с. 3094-3098 (1973).

14. Уэй, М., и CP Станнерс, "Выделение и характеристика мутантов СНО ячейки с измененной синтетазы аспарагин," Somalie Сотовый Жене., 5 (5), с. 625-639 (1979).

15. Figler, H., и др.. ", Аллостерические усилители Аль-рецепторов аденозина увеличение связи белка рецептора-G и противодействовать Гуанин нуклеотидов воздействие на агонист обязательным", мол. Pharmacol., 64 (6), с. 1557-1564 (2003).

16. Hornigold, округ Колумбия, и др.., "Свидетельство перекрестных помех между М2 и М3 мускариновых рецепторов ацетилхолина в регуляции второй посыльный и внеклеточной регулируемой киназы сигнальных путей в клетках яичника китайского хомячка," Бр. J. Pharmacol., 138 (7), с. 1340-1350 (2003).

17. Шульте, Г. и Б. B. Фредгольма. "G (S)-связанных аденозина (2B) рецепторов новобранцев различные пути для регулирования ERK1 / 2 и p38," Exp. Сотовый Рез., 290 (1), с. 168-176 (2003).

18. Хари, М., и др.. ", Мутации в альфа-и бета-тубулина, что стабилизации микротрубочек и устойчивости к colcemid и винбластин". Мол. Рак Там., 2 (7), с. 597-605 (2003).

19. Цзэн, В. и др.. ", ПРЛ-3 и ПРЛ-1 ячейки содействия миграции, вторжения, и метастазы". Биология., 63 (11). с. 2716-2722 (2003).

20. Fiore, М., и др. в. ", Реверсивный G (1) арест, диметилсульфоксид, как новый метод синхронизации клеток китайского hamsier", мутагенность, 17 (5), с. 419-424 (2002).

21. Батиста, LF, и др.. "Участие репликации ДНК в УФ-индуцированного апоптоза клеток млекопитающих", апоптоз, 11 (7), с. 1139-1148 (2006).

22. Dunkern, TR, Б. Kaina ", клеточной пролиферации и разрывы ДНК участвуют в УФ-свете-индуцированного апоптоза в нуклеотидных иссечение ремонт-дефицитных клеток китайского хомячка". Мол. / / Биол. Cell, 13 (1), с. 348-361 (2002).

23. Фернандес, MJ, и др.. ", Апоптоз, индуцированный различными дозами кофеина на клетки яичника китайского хомячка." J. Appl. Taxiol., 23 (4), с. 221-224 (2003).

24. Soloneski, С. и др. /., "Влияние dithiocarbamaie Цинеб пестицидов и коммерческие разработки, Azzurro. III. Генотоксического оценки яичника китайского хомячка (СНО) клетки". Mutat. Рез., 514 (1-2), с. 201-212 (2002).

25. Цай Ю., и др.., "Влияние О6-benzylguanine на азотистый иприт-индуцированной токсичности, апоптоз. Мутагенности и по-китайски клеток яичника хомяка", мол. Рак Там., 1 (1), с. 21-28 (2001).

26. Вурм, FM, "рабочие лошадки-системах млекопитающих отрасли выражение," Модем биофармацевтических препаратов, Wiley-VCH, Weiheim, 3, с. 723-759 (2005).

27. Вибе, ME, и др.. ", Комплексный подход к обеспечению, что рекомбинантные ДТС является свободным случайного вирус" Достижения в области клеточной биологии животных и техники, Butterworth-Heinemann, Лондон, с. 68-71 (1989).

28. Граф, LH-младший, Л. Chasin, "Прямые демонстрации генетических изменений в дигидрофолат локуса редуктазы после гамма-облучения". Мол. Сотовый биологии., 2 (1), с. 93-96 (1982).

29. Urlaub, Г. и др. /., "Исключить диплоидных dihydrofolale локуса редуктазы из культивируемых клеток млекопитающих", Cell, 33 (2), с. 405-412 (1983).

30. Као, Ф. Т. и Т. Т. шайба. "Генетика соматических клеток млекопитающих. VII. Индукция и изоляции пищевых мутантов клеток китайского хомячка," Proc. Натл. Акад. Наука США, 60 (4), с. 1275-1281 (1968).

31. Жиро, П. и Н. Мермод "Использование scalfold / maitrix привязанности регионов для белка," Перенос генов и экспрессия в клетках млекопитающих, Elsevier, Амстердам, с. 359-379 (2003).

32. Антониу, М., и др.. ", Охватывающей трансгенов двойного промоторов CpG островов от человека ТБФ и HNRPA2B1 локусов устойчивы к гетерохроматина опосредованного глушителей". Геномики, 82 (3), с. 269-279 (2003).

33. Сет, Г. и др. /., "Инженерная клеток для клеточной культуры биопереработки-физиологические основы", Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 101, с. 119-164 (2006).

34. Ирани Н. и др.. "Улучшение первичной метаболизма клеточных культур путем введения новых цитоплазматических пирувата реакции карбоксилазы". Biotechnol. Bioeng., 66 (4), с. 238-246 (1999).

35. Чон, DW, и др.. "Действие лактата дегидрогеназы подавления и глицерин-3-фосфат дегидрогеназы гиперэкспрессия на клеточный метаболизм", мол. Сотовый Biochem., 284 (1-2), с. 1-8 (2006).

36. Wlaschin, KF, и Ху Цзиньтао, "Инженерная метаболизм клеток с высокой плотностью клеточных культур с помощью манипуляций сахара транспорта". J. Biotechnol., 131 (2), с. 168-176 (2007).

37. Мастранжело, А. и др. /. ", Часть II. Сверхэкспрессия BCL-2 членов семьи повышает выживаемость клеток млекопитающих в ответ на различные оскорбления культуры", Biotechnol. Bioeng., 67 (5), с. 555-564 (2000).

38. Минтс, H., и др.. "Влияние коэкспрессия и coamplification из SICAM и antiapoptosis детерминанты bcl-2/bcl-x (L) на продуктивность, выживаемость клеток, и число митохондрий в СНО-DG44, выращенных в подвеске и бессывороточной СМИ ", Biotechnol. Bioeng., 80 (6), с. 706-716 (2002).

39. Sriburi, Р. и др. /. ", XBP1: связь между развернул ответ белка, липидов биосинтеза и биогенеза эндоплазматического ретикулума," J. Cell. / / Биол., 167 (1), с. 35-41 (2004).

40. Эллиотт, С. и др. /., "Расширение терапевтических белков в естественных условиях деятельности через glycoengineering", Nat. Biotechnol., 21 (4), с. 414-421 (2003).

41. Wong, округ Колумбия, и др.. ", Транскрипции профилирования апоптоза в пакетном режиме и кормили-СНО партии культур клеток" Biotechnal. Buteng., 94 (2). с. 373-382 (2006).

42. Van Dyk, DD и др., "Выявление клеточных изменений, связанных с увеличением производства гормона роста человека в рекомбинантных яичника китайского хомяка клеточной линии". Протеомика, 3 (2), с. 147-156 (2003).

43. Кауфман, H., и др.., "Влияние низкой температуры на производительность, протеома и фосфорилирование белков клеток СНО". Biotechnol. Bioeng., 63 (5), с. 573-582 (1999).

44. Wlaschin, KF и др.., "EST последовательности генов открытия в китайской клетки яичника хомяка", Biotechnol. Bioeng., 91 (5), с. 592-606 (2005).

45. Wlaschin, KF, и Ху Цзиньтао ", строительные леса для китайского хомяка генома", Biotechnol. Bioeng., Epub перед печатью (2007).

Karthik П. JAYAPAL

KATIE F. WLASCHIN

Wei-ШОУ HU

Университет штата Миннесота

МИРАНДА Г. С. YAP

BIOPROCESSlNG технологический институт медико-биологических наук ИНСТИТУТЫ

Karthik П. JAVAPAL является научный сотрудник и аспирант кафедры химической технологии и материаловедения в университете штата Миннесота. Он получил степень бакалавра в области химического машиностроения Индийский технологический институт в Мадрасе. Его исследования направлены на сравнительной геномике антибиотика производства стрептомицетов и транскриптом / протеома анализа.

KATIE F. WLASCHIN, доктор философии, технический специалист с Консорциумом для китайского хомячка яичников Сотовый Геномика и научный сотрудник в Институте биотехнологии, Университет штата Миннесота. Она сыграла важную роль в улучшении технического проекта СНО. Ее область исследований включает в себя анализ СНО транскриптом, клеточная инженерия и метаболической инженерии клеток млекопитающих.

Wei-ШОУ Ху Цзиньтао, доктор философии, почетный профессор Университета Мак-Найт на факультете химической технологии и материаловедения СО РАН в университете Миннесоты (421 Washington Ave. SE., Minneapolis, MN 55455, телефон: (612) 625-0546; Факс: (612) 626-7246, E-почта: <a href="mailto:acre@cems.umn.edu"> acre@cems.umn.edu </ A>). Его исследования в настоящее время основное внимание уделяется широкому кругу клеточных культур техники, особенно выяснение генов черта отношений через транскриптом / протеома анализа.

МИРАНДА С. YAP, доктор философии, исполнительный директор биотехнологической-технологический институт в Сингапуре (20 Биополис уэй