Расшифровка механизмы терапевтического белка
Спрос на терапевтическое рекомбинантных белков, в конечном счете превысит нынешние возможности производства. Это является основной движущей силой в дальнейшем понимании яичников китайского хомячка (СНО) клеточной биологии, которая является клеточная линия выбора для производства этих протеинов. Дальнейшее R
Производство терапевтических рекомбинантных белков млекопитающих из систем является одним из наиболее быстро растущих сегментов фармацевтического рынка (1). Некоторые результаты анализов свидетельствуют, что спрос будет опережать производство в конечном итоге этих белков. Это неизбежный дефицит служит, чтобы подчеркнуть необходимость улучшить доходность, которая может быть получена из системы в настоящее время. Большинство из этих белков производятся в яичников китайского хомячка (CHO) клеток, а остальные производятся в различных других типов клеток, в том числе мыши myelomas НСУ и SP2 / 0, детское хомяка почек (ВНК), а также ряд других. СНО клетки культивировали в первую конце 1950-х после их изоляции от китайского хомячка (Cricetulus пзеиз) эпителиальной опухоли яичников (2). Произведено в СНО, ДТС был первый из этих рекомбинантных белков на получение разрешения на терапевтическое использование в 1986 году (3). Многие изменения в процессе произошли с того времени, в том числе изменения в клетках, среднего роста и реактор условий для улучшения от первого предприятия ..
СНО остается доминирующей силой в биофармацевтического производства, поскольку оно представляет собой линию клеток, которая способна включения соответствующих после модификаций, и в то же время поддерживать характеристики идеально подходят для производства культуры. Они легко сохранить в сыворотке крови, свободной подвески культуры, с высокой плотностью жизнеспособных клеток и удельную производительность белка. Большинство коммерческих процедуры могут регулярно достигать титров в 2-5 г / л рекомбинантных белков с использованием методов сегодня. Это представляет собой огромный шаг по 50-100 мг / л титры достигнута в ходе процессов над 10 лет назад. Эти постепенные изменения в уровне производства во многом обязаны своим успехом повышение уровня знаний о биологии клетки в культуре, что привело к изменениям в СМИ формулировок и улучшений в процессы, используемые для культуры клеток (отзывов работах. 3, 4 и 5 ).
Первоначально эти изменения были основаны на принципах питания биохимии и формулировки были изменены, чтобы повлиять на общее состояние здоровья и метаболизма клеток в культуре. Как тенденций в культуре исполнении не наблюдалось при добавлении отдельных компонентов, эти компоненты были впоследствии изменены с помощью отдельных титрования для улучшения СМИ формулировок. Постепенно, что акцент сместился на статистических подходов, предназначенных для проверки синергетического эффекта между несколькими компонентами в разработке. За это время было также парадигмы в нормативной области для биофармацевтических препаратов. Средний формулировок отошли от использования животных компонентов в рецептуре (особенно плода бычьей сыворотки), чтобы еще больше нормативно-дружественных определенным химическим компонентам. Другие улучшения в реакторной технологии, инженерные линии клеток и клонирования выбор также привели к улучшению продуктивности.
В совокупности эти изменения дали нам относительно высокий уровень производительности, который мы имеем сегодня, но для того, чтобы сделать следующие шаги, было бы целесообразно использовать современные молекулярные методы, чтобы добиться лучшего понимания клеточной биологии СНО. Имея это в виду, Есть несколько возможных подходов к получению этих знаний, в том числе пытаясь понять, что ответ ячейки того, чтобы стимул путем мониторинга изменений в уровнях транскрипт (геномной / транскриптомных методы) или белка (протеомных методов). Кроме того, можно контролировать уровни метаболитов с использованием различных масс-спектрометрии основан методы, называемые метаболомики. В сочетании, эти технологии могут дать нам гораздо более широкое понимание того, что на самом деле происходит внутри клеток в культуре. Надеемся, что это приведет к развитию клеток с улучшенными характеристиками, таких как улучшение жизнеспособных плотность клетки, удельная производительность и эпигенетических стабильности.
Дальнейшие исследования СНО биологии
Повышение доступности геномной информации способствовало быстрому росту области геномики, предоставляя исследователям доступ к необходимой информации последовательности. Это позволило значительно ускорить разработку высокопроизводительных исследуемого средства, такие как микрочипы, которые традиционно используются для идентификации генов, которые играют важнейшую роль в той или иной фенотип, таких, как гены дифференциально регулируется в сравнении с больными нормальной ткани. В настоящее время становится обычной практикой, чтобы использовать эту геномики транскриптомику подход к обеспечению более глубокого понимания клеточных культур млекопитающих, особенно с имеющимися геномных последовательностей. Одним из первых исследований, в которых микрочипов Эксперименты проводились в связи с этим была одна, где ученые надеялись получить более глубокое понимание физиологическая реакция фибробластов человека в сыворотке крови (6). Microarrays также были использованы биофармацевтической группы для изучения экспрессии генов профилей мыши клеточных линий (НСО), которые производят большое количество терапевтических белков (7, 8) ..
Чем больше СНО-определенной последовательности появления новой информации, исследователи используют микрочипы для ускорения развития клеток СНО линии и биотехнологических оптимизации. В последнее время выразил последовательность метки (ЭТ) с СНО, были использованы для создания СНО-специфических ДНК-микрочипов, которая была использована для выполнения сравнительного анализа между транскрипционных производства рекомбинантных СНО и мышь гибридомной клеточных линий (9, 10). Интересно, что Де-Леон Гатти и др. показали, что тщательно разработанные мыши зондов и последующих микрочипы могут быть использованы для характеристики транскриптом СНО ячейки (9). Другие исследования микрочипов в СНО были сосредоточены на транскрипционных профилей для изучения индукции апоптоза, либо для выявления ключевых генов, связанных с производительностью рекомбинантных белков (11,12).
Учитывая частоту СНО-производственной стратегии на рынке, это удивительно, что биохимические показатели, которые определяют высокий видов клеток линии СНО остаются так плохо. На сегодняшний день в геном китайского хомяка не совсем последовательно и информации, которая доступна не является свободно доступным. Это послужило существенным препятствием для ученых желающих определить генома или транскриптом изменений, которые играют важную роль в высоких производственных линий, что затрудняет рационально инженер эти черты в новых линий. Мы разработали стратегию, которая использует микрочипов для выяснения генетических путей и выявления различных биомаркеров, которые характерны высокая производству клеточной линии. Затем эта информация переводится на усилия для развития средств массовой информации дополнений к повышению общей эффективности рекомбинантного белка из линии клеток животных и разработки генно-инженерных клеточной линии, которая улучшенной производительностью.
Для того, чтобы построить функциональную платформу микрочипов, мы первые создали базу данных СНО последовательности. В рамках нашего сотрудничества с Консорциумом по яичников китайского хомячка Сотовый геномики, а также наши собственные усилия, последовательность, мы построили базу данных СНО, содержащий около 21000 уникальных последовательностей СНО, о которых 9000 кодируют известных белков. Сейчас мы собрали 64 162 комбинированных СНО экологически безопасных технологий (10) и продолжать обновлять эту базу данных с новыми добавлениями последовательности.
С помощью этой базы данных, мы разработали микрочипов СНО для выявления изменений в транскриптом в различных клонов СНО. Наш нынешний дизайн микрочипов СНО содержит 30784 зондов предназначена нашего СНО последовательность базы данных, которая состоит как из геномной и митохондриальной полученных последовательностей, 10505 ортологичных последовательности из известных белков кодирования генов, которые отсутствовали в нашу нынешнюю базу данных СНО, 2488 зондов, которые представляют наши хозяйства и выбор маркер контроля генов и генов, не 1417-СНО контроля. На основании информации, мыши запись можно получить FANTOM3 аннотации и последовательность сравнению исследований, проведенных между СНО и мышь, мы прогнозируем, что наш массив охватывает большую часть предсказал СНО транскриптом (W, 13). Мы в настоящее время используют Agilent 4 х 44 к пользовательской платформы массив для выполнения всех наших экспериментов микрочипов. Эта платформа соответствует нашим потребностям в отношении гибкости, мы можем с легкостью добавлять или редизайн нашего массива с пополнением СНО специфических зондов, как наши СНО последовательность базы данных продолжает расти ..
Короче говоря, наши экспериментальные стратегии рассматриваются профили экспрессии генов из нескольких переменных, включая измерения в течение времени, конечно, производить различные фенотипы, а также множество различных клеточных линий, чтобы получить общий профиль экспрессии генов синонимом любых условиях. Эти профили экспрессии генов, то для минных биологическое значение на основе детального анализа путей и молекулярный анализ использования сети GeneSifter и изобретательность программного обеспечения (рис. 1). Мы верим, что мы по-прежнему строить этот набор данных с более фенотипов мы сможем определить общие между ними, которые приводят к выявлению ключевых генов, связанных с наиболее важными путями для высокопроизводительной клонов СНО.
СНО биологии оказывает влияние
Гена целевых показателей в производстве высокой СНО клеточных линий определены на основе анализа микрочипов и других аналитических методов обеспечить разнообразный набор потенциальных биомаркеров, которые должны быть проверены на их влияние на производительность. Одним из первых основных этапов проверки и применения определенных целей ген комплексный анализ путей для классификации отдельных задач в функциональных категорий или ключевых сигнальных каскадов на основе генной аннотации. Эти категории и / или каскады могут быть оценены на предмет их потенциального воздействия на производство белка. После того как ключевые цели генов и биологических путей были выявлены несколько различных подходов могут быть приняты для изменения внутриклеточной активности этих генов и / или пути, при этом конечной результате чего увеличилось производство терапевтических белков и производстве терапевтических белков с повышенной эффективностью. Уровня экспрессии белков ключ может быть изменено с помощью механизмов нокдаун гена или трансгена за выражение. Кроме того, основанных на недавнее соглашение между Sigma-Aldrich и Сангамо Biosciences, генетические изменения могут быть сделаны с помощью цинка палец нуклеаз (ZFNs) (14).
Кроме того, белки и / или малых молекул могут быть добавлены в питательной среде клетки, тем самым, регулирующего деятельность ключевых внутриклеточных сигнальных каскадах. В следующих разделах, каждый из этих приложений будут описаны более подробно, а также примеры будут предоставляться ..
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой последовательность конкретных, посттранскрипционного механизм генной глушителей, что опосредовано двуспиральной молекулы РНК (15, 16). Одна группа коротких функций РНК-дуплексы в качестве шаблона, ведущие к деградации мРНК дополнительных (17). RNAi могут быть вызваны в клетках млекопитающих по трансфекции либо синтетических краткосрочные вмешательства РНК (siRNAs) или выражение векторов кодирования на короткий шпильки РНК (shRNAs), которые затем перерабатываются в siRNAs внутри клеток. RNAi в настоящее время широко используются в качестве генов млекопитающих стратегии в терапевтических систем производства белка. Лим и др.. использовать RNAi в нокдаун выражение про-апоптотических генов Bax и Бак в рекомбинантных СНО Kl клеточной линии производства интерферона-A (18). Эти клетки проявили увеличенный срок службы и более жизнеспособным плотности ячейки в культуре надоело партии, что ведет к росту производства рекомбинантных терапевтических протеинов. В другом исследовании, Мори и др. использовали RNAi в нокдаун экспрессии генов др., 6 fucosyltransferase (Fut8) в CHODG44 клеточной линии по производству рекомбинантных моноклональных антител (19).
Результатом этого стало производство defucosylated антител с повышенным антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ПКК). Ngantung и др.. использовать другой подход RNAi, чтобы помочь улучшить производства функциональных рекомбинантного белка из клеток СНО на снос нейраминидазной в рекомбинантных клеток линии СНО выразил IFN- Нейраминидазной это фермент, который расщепляет терминала сиаловых кислот на рекомбинантных белков. Desialylated гликопротеины имеют значительно более низкие полураспада кровообращения, снижение общего качества продукта ..
Мы разработали высокой пропускной методом с использованием RNAi и технологии сотовых Xpress Руководствуясь Лазерная включен анализ и обработка (LEAP), чтобы оценить последствия целевых нокдаун гена proauction терапевтических белков. LEAP инструмент, изготовленный Cyntellect, является уникальной лазерной системы на основе ячейки обработки изображений, которая объединяет ячейки и лазерно-опосредованной ячейки манипуляций в автоматизированных и высокой пропускной образом через большое поле зрения оптики и гальванометра руля. Сотовый платформы Xpress представляет собой автоматизированную протокол, который работает с изображениями и лазерной очистки опосредованных функций прибора LEAP. Мы использовали возможности воображения клеточной Xpress быстро количественно IgG секреции из клеток СНО (рис. 2). Эта система дает нам фенотипические анализа, что мы можем использовать для проверки воздействия siRNAs предназначены против наших целей микрочипов. После переходного целевых нокдаун гена были утверждены для желаемого влияния на производительность, мы можем инженер стабильной линии СНО с повышенной рекомбинантного белка производственные возможности использования shRNA технологии RNAi Консорциум Sigma-Aldrich в ..
Целевой ген над выражение является еще одним распространенным исследователей подход используется для изменения внутриклеточной активности ключевых белков и / или путей с целью иметь позитивное влияние на терапевтический производства белка млекопитающих систем. Например, Феррара и др.. использовать НЕК293 переходного системы выражение coexpress моноклональных антител тяжелых и легких цепей генов, а также ген, кодирующий рекомбинантный Они показали, что чрезмерная экспрессия GNT-III приводит к антителам обогащенный пополам олигосахаридов, а также nonfucosylated и гибридных олигосахаридов, увеличивая тем самым зависимых антител клеточной цитотоксичности (ПКК). Sauerwald и др.. генерируется стабильной линии СНО-за выражения несколько ингибиторов апоптоза (22). Они показали, что одновременное чрезмерной экспрессии как вверх, так и вниз по течению ингибиторы апоптоза идет на пользу продления жизни СНО культуре клеток. Multigene инженерии, а в последнее время подход, в котором целевого гена сбить и за выражение технологий в настоящее время используются одновременно.
При этом, можно изменить уровень экспрессии эндогенных нескольких различных генов в той же линии рекомбинантных клеток. Например, Greber и Fussenegger инженерии система, в которой генов-мишеней может быть и более выраженной и разборный (23). Они разработали multicistronic векторы, которые способны согласованных выражение на срок до трех трансгенов и 3 siRNAs от одного генетического платформы. Поскольку наши знания о генетических СНО ячейки производственных систем возрастает, такие технологии, как это окажется неоценимым в клеточной линии инженерных усилий ..
Движение вперед
С началом большой толчок, чтобы все млекопитающих терапевтической системы производства сыворотки бесплатно, или даже с определенным химическим, один из наиболее распространенных подходов к оптимизации терапевтического белка из клеток СНО была путем создания расширенной формулировки средств массовой информации. Кроме того многие добавки средств массовой информации, в том числе факторы роста, гормоны, транспортных белков, углеводов и других малых молекул, основанный на состав сыворотки, а общий эффект этих добавок на клеточной биологии СНО не были четко определены. В данных, полученных от наших СНО геномики транскриптомику исследований и пути анализа, мы будем иметь возможность принимать более рационального подхода к проектированию средств массовой информации и выявления ключевых белков и / или малых молекул, которые могут быть добавлены в культуре клеток среднего по регулированию деятельности ключевых внутриклеточных сигнальных каскадов, которые участвуют в терапевтических белка.
Мы считаем, что, принимая системного подхода, биология открытие увеличить наше понимание СНО клеточной и молекулярной биологии, мы сможем определить ключевые цели генов и клеточных сигнальных путей, которые могут быть модулируется оказывать существенное влияние на рекомбинантных терапевтических белка. Как было описано ранее, мы имеем в настоящее время установлены и утверждены внутренние RNAi отбора анализа, а также трансгенов на выражение системы, которые могут быть использованы для инженера лучше клеточных линий для терапевтического белка. Кроме того, мы считаем, что информация, полученная от наших геномики транскриптомику исследования позволят нам разработать более культуры клеток в формулировках.
ЛИТЕРАТУРА
1. Walsh, G "" Biophamaceutical критериев 2006 ", Nat Biotechnol., 24, с. 769-776 (2006).
2. Puck, TT, SJ Cieciura и А. Робинсон, "Генетика соматических клеток млекопитающих. III, долгосрочный выращивания euploid клетки человека и животных, предметы," J, Exp. Med., 108, с. 945-956 (1958).
3. Вурм, FM, "Производство рекомбинантных белков терапии в культурных клетках млекопитающих", Nat Biotechnol. 22, с. 1393-1398 (2004).
4. Dinnis, DM, DC и Джеймс, "Инженерная млекопитающих заводов ячейки для улучшения recombinanl моноклональных антител: уроки природы?", Biotechnol. Bioeng., 91, с. 180-189 (2005).
5. Korke, Р. и др. /. ", Геномики и протеомных перспективы клеточной инженерии культуры", J. Biotechnol., 94, с. 73-92 (2002).
6. Айер, В. Р. и др.. ", Транскрипционные программы в ответ фибробластов человека в сыворотке крови". Наука. 283. с. 83-87 (1999).
7. Сет, Г. и др. при, "Молекулярная портрет высокой производительности в рекомбинантные клетки НСО". Biotechnol. Bioeng., 97. с. 933-951 (2007).
8. Шен, Д. и ST Sharfstein ", генома анализ транскрипционных ответ мышей гибридом к осмотическому шоку". Biosechnol. Bioeng., 93, с. 132-145 (2006).
9. Де Леон, М., и др.. "Сравнительный анализ транскрипционных гибридомной мыши и рекомбинантных яичника китайского хомяка клетки проходят лечение бутират". J. Biosci. Bioeng., 103. с. 82-91 (2007).
10. Wlaschin, К. E, и др.., "EST последовательности генов открытия в китайской клеток яичника хомяка", Biotechnol. Bioeng., 91, с. 592-606 (2005).
11. Wong, округ Колумбия, и др.., 'Транскрипции профилирования apoptolic пути в партии и партии надоело культур СНО ячейки ", Biotechnol. Bioeng., 94, с. 373-382 (2006).
12. Nissom, ТЧ, и др.. ", Транскриптом и протеома профилей для понимания биологии клетки СНО высокой производительности", мол. Biotechnol., 34, с. 125-140 (2006).
13. Маеда, Н. и др.., "Стенограмма аннотации в FANTOM3: каталог генов мыши на основе физических кДНК," PLoS. Жене., 2, p. E62 (2006).
14. Reik, А. и др. /. "Укрепление белка производства инженерных белков палец цинк", Biotechnol. Bioeng., 97. с. 1180-1189 (2007).
15. Sharp, П. A., "RNAi и дважды цепи РНК". Гены Dev., 13, с. 139-141 (1999).
16. Сэнди, П., А. Вентура, Т. Тали, "млекопитающих RNAi: практическое руководство". Биотехнологий, 39, с. 215-224 (2005).
17. Рао, М. и С. Sockanathan, "Молекулярные механизмы RNAi: последствия для развития и болезней". Врожденных дефектов Рез. C. эмбрионов - Сегодня, 75, с. 28-42 (2005).
18. Лим, SF и др.. ", RNAi подавления Bax и Бак повышает жизнеспособность в фейль-Бейч культурах клеток СНО", Metab Eng. 8, с. 509-522 (2006).
19. Мори, К., и др.., "Инженерная клеток китайского хомячка яичника максимально эффекторные функции производства антител использованием FUT8 Серна", Bioiechnol. Bioeng., 88, с. 901-908 (2004).
20. Ngantung, Ф. и др. /., "РНК-вмешательство нейраминидазной улучшает гликопротеина сиаловых последовательности Контера кислоты", Bioiechnoi. Bioeng., 95, с. 106-119 (2006).
21. Феррара, К., и др.. ", Модуляция терапевтических эффекторных функций антител к гликозилирования техники: влияние Гольджи фермент область локализации и сотрудничества экспрессии гетерологичных Бетал, 4-N-acetylglucosaminyltransferase III и Гольджи альфа-mannosidase II.", Biotechnol . Bioeng., 93, с. 851-861 (2006).
22. Sauerwald, ТМ и др.., "Объединение каспаз и митохондриальной дисфункции ингибиторы апоптоза ограничить гибель клеток в культурах клеток млекопитающих", Biotechnol. Bioeng., 94, с. 362-372 (2006).
23. Greber, Д. и М. Fussenegger, "Multi-генной инженерии: одновременное выражения и сногсшибательно шести генов с одной платформы,''Biotechnol Bioeng., 96, с. 821-834 (2007).
Daniel W. ALLISON, TRISSA BORGSCHULTE, Кристоф Л. BAUSCH, Скотт М. Бахр, Мэттью В. Кейпл, Кевин Дж. Кайзера
SAFC Biosciences, DIV. О Sigma-Aldrich
Daniel W. ALLISON, доктор философии, является одним из главных R
TRISSA BORGSCHULTE, доктор философии, старший R
CHRISTOPH Л. BAUSCH, доктор философии, старший R
SCOTT М. Бахр является ассоциированным R
МАТФЕЯ В. Кейпл является директором R
Кевин I. Кайзер, ПНД, является R
